La aparición se inició el 9 de diciembre de 1531 en las cercanías de la Ciudad de México, entonces ciudad capital del imperio Azteca:
la Virgen se aparece al indio Juan Diego, y le pide que transmita al obispo del lugar su voluntad de que se construya un templo dedicado a Ella en el cerro Tepeyac.
El obispo, al escuchar el relato del indio, le pide una prueba de la Presencia de la Madre de Dios allí.
María hace crecer entonces un jardín de rosas en un cerro inhóspito y semidesértico,
y se las hace recoger en su tilma (especie de poncho o manta) a Juan Diego. Luego le pide se las presente como prueba de Su Presencia al obispo.
Cuando el indio abre su tilma frente al obispo, caen las flores al piso y aparece milagrosamente retratada la imagen de la Virgen María en la rústica tela.
El templo dedicado a la Virgen de Guadalupe fue construido en el cerro Tepeyac, lugar de las apariciones, donde se exhibe la tilma original de Juan Diego, impresa con la mundialmente conocida imagen de la Virgen de Guadalupe
Estudios oftalmológicos realizados a los ojos de María han detectado que al acercarles luz, la pupila se contrae,
y al retirar la luz, se vuelve a dilatar,
tal cual como ocurre en un ojo vivo.
¡Los ojos de María están vivos en la tilma!.
También se descubre que los ojos poseen los tres efectos de refracción de la imagen que un ojo humano normalmente posee.
Lograr estos efectos a pincel es absolutamente imposible,
aún en la actualidad.
No se ha descubierto ningún rastro de pintura en la tela.
De hecho, al acercarse uno a menos de 10 centímetros de la imagen, sólo se ve la tela de maguey en crudo.
Los colores desaparecen.
Estudios científicos de diverso tipo no logran descubrir el origen de la coloración que forma la imagen, ni la forma en que la misma fue pintada. No se detectan rastros de pinceladas ni de otra técnica de pintura conocida.
El Dr. Phillip S. Callaghan, del equipo científico de la NASA americana, biofísico de la Universidad de Kansas (EE.UU.), investigador, científico y técnico en pintura, y el Profesor Jody Brant Smith, «Master of Arts», de la Universidad de Miami, Catedrático de Filosofía de la Ciencia en la Universidad de Pensacolla, afirmaron que el material que origina los colores no es ninguno de los elementos conocidos en la tierra.
En su libro «La tilma de Juan Diego» exponen el estudio realizado por ellos a nivel particular.