Nacque a Sebenico, in Dalmazia, figlia di due italiani autoctoni, Paolo e Filomena Rossini. La famiglia era una delle più ricche della città, tanto che il teatro principale di Sebenico era intitolato all'avo mecenate Francesco Mazzoleni. Questa intitolazione venne modificata solo nel 1945. Ester Mazzoleni aveva una sorella - Ida - e due fratelli: Giovanni e Enrico. Dopo gli studi  esordì ne Il trovatore nel 1906 al teatro Costanzi di Roma. La sua carriera fu eccezionale, esordendo solo sue anni dopo alla Scala di Milano. Proprio alla Scala cantò alla prima esecuzione italiana della Medea, il 30 dicembre 1909. Nelle sue corde vi furono anche personaggi molto differenti, come Isotta e Norma. Celebre rimane la sua Aida, in occasione dell'apertura dell'Arena di Verona nel 1913. Ester Mazzoleni tornò acclamatissima nella città scaligera in occasione del cinquantenario dell'evento. Sposò, nel 1925, un gentiluomo palermitano e si trasferì perciò a Palermo. In seguito al matrimonio, annunciò il proprio ritiro dalle scene nel 1926. Morì a Palermo il 17 maggio 1982, a novantanove anni. In sua memoria è sorta a Palermo l'Associazione Amici dell'Opera Lirica "E. Mazzoleni"; essa ha istituito il premio Ester Mazzoleni "Una vita per la lirica", che viene assegnato ogni anno a prestigiose personalità del melodramma.